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定点突变
概念定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的添加、删除、点突变等。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。单酶切反应产物,直接转化EcoliBMH71-18mutS(错配修复缺陷株)。
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聚合酶链式反应
参与PCR反应体系的因素及其作用:参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。当用RNA作模板时,首先要进行反转录生成cDNA,然后再进行正常的PCR循环。因此不应错配。浓度太高,容易生成引物二聚体,或非特异性产物。
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PCR
参与PCR反应体系的因素及其作用:参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。当用RNA作模板时,首先要进行反转录生成cDNA,然后再进行正常的PCR循环。因此不应错配。浓度太高,容易生成引物二聚体,或非特异性产物。
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聚合酶链反应
参与PCR反应体系的因素及其作用:参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。当用RNA作模板时,首先要进行反转录生成cDNA,然后再进行正常的PCR循环。因此不应错配。浓度太高,容易生成引物二聚体,或非特异性产物。
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PCR实验技术
3.促进PCR的添加剂退火温度,引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增,但是,某些模板,包括高GC含量的模板,需要其他的措施。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA:1.PCR用水应为高压的双蒸水;下一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。